QUI
TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE
1. MỤC ĐÍCH:
Phát
hiện các gen đặc hiệu và gen độc tố tả (cholera toxin A) của V. cholerae O1,
O139 và NAG.
2. PHẠM VI ÁP
DỤNG
Phát
hiện V. cholerae và độc tố tả từ các chủng vi khuẩn hoặc trực tiếp từ
phân, thực phẩm, nước.
3. NGUYÊN TẮC
Sử
dụng các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn gen mã hóa V. cholera O1,
O139, NAG và độc tố tả (cholera toxin A) bằng phản ứng chuỗi men. Quá trình này
được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài
phân tử ADN ban đầu qua đó có thể phát hiện được các đoạn gen dưới đèn UV sau
khi điện di.
4.
TRÁCH
NHIỆM
§ Cán
bộ thực hiện:
- Thực
hiện thao tác xét nghiệm.
- Đảm
bảo các mẫu bệnh phẩm được dán nhãn đúng và ghi vào sổ nhận mẫu.
- Hoàn
tất báo cáo trả lời kết quả xét nghiệm.
- Đảm
bảo kiểm soát chất lượng nội bộ phù hợp với tiêu chuẩn.
§ Trưởng
phòng thí nghiệm:
- Duyệt
lại các kết quả xét nghiệm.
- Cập
nhật các thay đổi của qui trình.
5.
AN
TOÀN
§ Mặc
áo choàng, mang găng tay và khẩu trang khi tiếp xúc với các mẫu bệnh
phẩm.
§ Mang
găng tay suốt quá trình thao tác kỹ thuật PCR.
6.
THÔNG
TIN MẪU BAN ĐẦU
|
STT
|
Tên
mẫu
|
Dụng
cụ chứa
|
Chất
thêm vào
|
Số
lượng cần có
|
Yêu
cấu về vân chuyễn và lưu giữ
|
|
1
|
Chủng
vi khuẩn
|
Thạch
mềm hoặc thạch dinh dưỡng
|
Không
|
|
Nhiệt
độ phòng (2-4 tuần)
|
|
2
|
Phân
|
Lọ
vô trùng
|
Không
|
3
g
|
Nhiệt
độ phòng (giữ trong ngày)
2-80C
(<2 ngày)
|
|
3
|
Nước
|
Chai
sạch
|
Pepton
kiềm 10X
|
450ml
|
Giữ
ở nhiệt độ phòng <3 ngày
|
7. TRANG
THIẾT BỊ-HÓA CHẤT-SINH PHẨM
7.1.
Thiết
bị:
§ Máy
luân nhiệt :Mastercycler eppendorf
§ Máy
chụp gen
§ Máy
điện di
§ Máy
ly tâm eppendorf 10.000
§ Máy
lắc có điều chỉnh nhiệt độ
§ Máy
khuấy từ
§ Máy
trộn vortex
§ Máy
đo pH
§ Cân
điện
§ Tủ
lạnh 40C, -200C và -800C
7.2.
Dụng
cụ:
§ Que
cấy vi khuẩn
§ Micropipette::
2,5; 10-50; 100-200 và 1000ml
§ Đầu
týp các cỡ
§ Tube
eppendorf các cỡ: 0,2; 0,5; 1,5ml
§ Hộp
để đầu týp
§ Giá
để đầu tube
§ Ống
nghiệm 12
§ Hộp
lồng, bình cầu, ống đong
§ Chai
0,5lít, 1 lít
§ Găng
tay các cỡ
7.3.
Sinh
phẩm hóa chất
Bảng
1: Các đoạn mồi dùng
trong kỹ thuật PCR phát hiện gen đặc hiệu của V. choleare
|
Tên
mồi
|
Trình tự
mồi
|
Gen chỉ
điểm
|
Kích thước gen
(bp)
|
|
VCO1 F2-1
VCO1R2-2
|
5’ GTT TCA CTG AAC
AGA TGG G 3’
5’ GGT CAT CTG TAA
GAT CAA C 3’
|
O1
|
192
|
|
VCO139F2
VCO139 R2
|
5’ AGC CTC TTT ATT
ACG GGT GG 3’
5’ GTC AAA CCC GAT
CGT AAA GG 3’
|
O139
|
449
|
|
AX2
AX3
|
5’ CGG GCA GAT TCT
AGA CCT CCT G 3’
5’ CGA TGA TCT TGG
AGC ATT CCC AC 3’
|
ctxA
|
564
|
|
101F
837R
|
5’ CCT TCG ATC CCC
TAA GCA ATA C 3’
5’ AGG GTT AGC AAC
GAT GCG TAA G 3’
|
ToxA
|
779
|
§ Canh
thang LB (promega)
§ Thạch
dinh dưỡng
§ NaCl
0,09%
§ Kít
tách chiết ADN (QIAGEN)
§ Dung
dịch đệm TAE 10X
§ Nước
cất
§ Thạch
điện di (electrophoresis agar)
§ Thang
chuẩn ADN 100bp
§ Ethidiumbromide
§ Chứng
dương:
o V.
cholerae O1:
VN01/07
o V.
cholerae O139:
AI4450
§ Chứng
âm: E. coli
8.
TIẾN
HÀNH KỸ THUẬT PCR
8.1.
Tách
chiết ADN khuôn mẫu:
8.1.1. Tách
chiết từ chủng vi khuẩn
- Lấy
4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất.
- Đun
cách thủy ở 950C trong 5 phút.
- Ly
tâm 10.000 vòng/2 phút lấy nước nổi làm khuôn mẫu ADN.
8.1.2. Tách
chiết trực tiếp từ phân: Sử dụng kit QIAGEN
- Nhỏ
300µl dịch phân tiêu chảy vào týp eppendorf 1,5ml có chứa 600µl NaCL
0.09%.
- Ly
tâm 2500 vòng x 2 phút để loại bỏ cặn.
- Hút
dịch nổi sang một týp eppendorf mới.
- Ly
tâm 13.000 vòng x 10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn.
- Trộn
đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch ALT.
- Nhỏ
20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex.
- Ủ
560C trong máy ủ nhiệt cho đến khi vi khuẩn ly giải hoàn toàn (thỉnh
thoảng mĩ nhẹ bằng máy trộn voltex).
- Trộn
đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch AL, trộn đều sau đó
nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều.
- Hút
toàn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1
phút.
- Nhỏ 500µl
dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
- Rửa
cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút.
- Chuyển
cột sang týp PCR sạch và nhỏ 75µl dung dịch AE vào trung tâm cột, để ở nhiệt độ
phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng x 1 phút thu ADN tách chiết để làm khuôn mẫu cho
phản ứng PCR.
8.2.
Chuẩn
bị hỗn hợp phản ứng PCR
8.2.1. Cách
pha mồi (primers) cho phản ứng PCR:
|
Primers
(mồi)
|
Primer
đặc(100µM/µl)
|
Nước cất siêu
sạch
|
Nồng độ pha
loãng
|
Primer cần dùng cho
30µl phản ứng
|
|
VCO1
F2-1
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.6µl
(0.5µM)
|
|
VCO1R2-2
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.6µl
(0.5µM)
|
|
VCO139F2
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.3µl
(0.25µM)
|
|
VCO139
R2
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.3µl
(0.25µM)
|
|
AX2
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl
(0.167µM)
|
|
AX3
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl
(0.167µM)
|
|
101F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl
(0.167µM)
|
|
837R
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl
(0.167µM)
|
8.2.2. Hỗn
hợp phản ứng cho PCR đa mồibằng
Master-Mix (promega)
|
Thành
phần phản ứng
|
1
mẫu (µl)
|
10
mẫu (µl)
|
|
2X Master-Mix:
|
15
|
150
|
|
Primers
(mồi)
|
VCO1
F2/R2
|
0.6µl/mồi
(0.5µM)
|
12
|
|
VCO139F2/R2
|
0.3µl/mồi
(0.25µl)
|
6
|
|
AX2/3
|
0.2µl
/mồi (0.167µM)
|
4
|
|
101F/837R
|
0.2µl
/mồi (0.167µM)
|
4
|
|
Nước
siêu sạch
|
9.4
|
94
|
|
Tổng
số:
|
27
|
270
|
§ Trộn
đều chia mỗi tube 27µl.
§ Cho
3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
8.2.3. Hỗn
hợp phản ứng cho PCR đơn mồi bằng Master-Mix (promega)
|
Thành phần phản
ứng
|
1 mẫu
(µl)
|
10 Mẫu
(µl)
|
|
2X Master-Mix
|
15
|
150
|
|
Cặp primers
|
VCO1F2
|
0.6
|
6
|
|
VCO1R2
|
0.6
|
6
|
|
Nước siêu sạch
|
10.8
|
108
|
|
Tổng số:
|
27
|
270
|
§ Trộn
đều chia mỗi tube 27µl.
§ Cho
3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
8.3.
Thực
hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt
|
Các
bước
|
Nhiệt
độ
|
Thời
gian
|
|
Biến tính
|
940C
|
5 phút
|
|
Biến tính
|
940C
|
60 giây
|
|
Gắn mồi
|
550C
|
60 giây 35
chu kỳ
|
|
Tổng hợp
|
720C
|
60 giây
|
|
Kết thúc
|
720C
|
7 phút
|
|
Giữ ở nhiệt độ
40C
|
8.4.
Điện
di sản phẩm PCR
§ Chuẩn
bị gel agarose 2%:
– Cân
1g thach cho vào dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch bằng lò vi
sóng.
– Để
thạch nguội khoảng 700C đổ khuôn tạo gel.
§ Nhỏ
mẫu:
– Đặt
bản gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TAE 1X.
– Rỏ
5µl thang ADN chuẩn 100bp, các chứng âm, chứng dương và sản phẩm PCR vào các
giếng thạch.
§ Chạy
điện di: Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút.
§ Nhuộm
và chụp ảnh gel:
– Nhuộm
gel trong dung dịch ethidium bromide (10mg/ml) trong 10 phút rồi rửa bằng nước
cất trong 15 phút.
– Soi
và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel BioDoc-itTM
System.
9.
PHÂN
TÍCH KẾT QUẢ
- Chứng
dương phải rõ ràng.
- Có
vạch trên gel và đúng kích thước khi so sánh với thang ADN chuẩn Vạch có hình
ảnh rõ nét, đẹp như hình 1.
Hình
1:
Kết quả PCR các chủng chứng dương và chứng âm của V. cholerae O1,
O139 và E. coli
- Nếu
vạch mờ, không rõ:
o Tăng
thể tích điện di.
o Thực
hiện lại phản ứng PCR.
- Mẫu
chứng âm không được có vạch nào, nếu thấy vạch là mẫu đã bị nhiễm và phải làm
lại xét nghiệm.
- Các
mẫu xét nghiệm được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước
tương ứng với các mẫu chứng và thang chuẩn ADN, ghi: (+).
- Các
mẫu không có vạch hoặc có vạch không đúng kích thươc được coi là âm tính, ghi
(-).
10. KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Độ
nhạy: 100vk/ml
- Độ
đặc hiệu: 100%
- Mẫu
chứng:
- Chứng
âm: E. coli (không có vạch)
- Chứng
dương:
o V.
cholerae
O1: VN107-07(kích thước band 192bp)
o V.
cholerae
O139: AI4450 (kích thước band 490bp)
o CtxA:
AI4450 (kích thước band 564bp)
PHIẾU TRẢ LỜI KẾT
QUẢ PCR
Người làm xét
nghiệm:……………………………………………………………………………..
Ngày làm xét
nghiệm:………………………………………………………………………………
1. Loại
mẫu:…………………………………………………………………………………...
2. Tách chiết ADN khuôn
mẫu:………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………..
3. Pha hỗn hợp phản ứng
PCR:
|
Hóa
chất
|
Thể tích cho 1 phản
ứng
|
Thể tích cho N phản
ứng
|
Nồng độ cuối
cùng
|
|
Nước
cất
|
9,4
|
9,4 x
N
|
|
|
Master mix
2X
|
15
|
15 x
N
|
1X
|
|
Mồi O1, O139, ctxA,
toxA
|
2,6
|
2,6 x
N
|
|
|
Tổng
số
|
27
|
|
|
4. PCR:
Máy……………………….Chu trình………………………………………………
5. Điện
di:Máy……… Thạch……%. Dung dịch đệm……... Công suất….. Thời
gian…..
6. Chụp ảnh gel và phân
tích kết quả:
|
STT
|
Tên
mẫu
|
Kết
quả
|
|
1
|
Chứng
dương
|
|
|
2
|
Chứng
âm
|
|
|
3
|
……..
|
|
|
4
|
……..
|
|
|
5
|
……..
|
|
|
6
|
……..
|
|
|
….
|
|
|
|
Cán bộ xét
nghiệm
|
|
Trưởng khoa vi
khuẩn
|