QUI
TRÌNH PCR PHÁT HIỆN GEN KHÁNG KHÁNG SINH
1.
MỤC ĐÍCH:
Phát
hiện các gen đặc hiệu mã hóa tính kháng kháng sinh của vi khuẩn.
2. PHẠM VI ÁP
DỤNG
Phát
hiện một số gen kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm từ các chủng vi khuẩn
gây bệnh phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng, các vụ dịch, và ở môi trường
ngoại cảnh.
3. NGUYÊN TẮC
Sử
dụng các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại một số đoạn gen kháng kháng sinh của vi
khuẩn bằng phản ứng chuỗi men. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp
hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài phân tử ADN ban đầu qua đó có thể
phát hiện được các đoạn gen dưới đèn UV sau khi điện di.
4. TRÁCH
NHIỆM
§ Cán
bộ thực hiện:
- Thực
hiện thao tác xét nghiệm.
- Đảm
bảo các mẫu bệnh phẩm được dán nhãn đúng và ghi vào sổ nhận mẫu.
- Hoàn
tất báo cáo trả lời kết quả xét nghiệm.
- Đảm
bảo kiểm soát chất lượng nội bộ phù hợp với tiêu chuẩn.
§ Trưởng
phòng thí nghiệm:
- Duyệt
lại các kết quả xét nghiệm.
- Cập
nhật các thay đổi của qui trình.
5.
AN
TOÀN
§ Mặc
áo choàng, mang găng tay và khẩu trang khi tiếp xúc với các mẫu bệnh
phẩm.
§ Mang
găng tay suốt quá trình thao tác kỹ thuật PCR.
6.
THÔNG
TIN MẪU BAN ĐẦU
|
STT
|
Tên
mẫu
|
Dụng
cụ chứa
|
Chất
thêm vào
|
Số
lượng cần có
|
Yêu
cấu về vân chuyễn và lưu giữ
|
|
1
|
Chủng
vi khuẩn
|
Thạch
mềm hoặc thạch dinh dưỡng
|
Không
|
|
Nhiệt
độ phòng (2-4 tuần)
|
7.
TRANG
THIẾT BỊ-HÓA CHẤT-SINH PHẨM
7.1.
Thiết
bị:
§ Máy
luân nhiệt :Mastercycler eppendorf
§ Máy
chụp gen
§ Máy
điện di
§ Máy
ly tâm eppendorf 10.000
§ Máy
lắc có điều chỉnh nhiệt độ
§ Máy
khuấy từ
§ Máy
trộn vortex
§ Máy
đo pH
§ Cân
điện
§ Tủ
lạnh 40C, -200C và -800C
§ Tủ
ấm
7.2. Dụng
cụ:
§ Que
cấy vi khuẩn
§ Micropipette::
2,5; 10-50; 100-200 và 1000ml
§ Đầu
týp các cỡ
§ Tube
eppendorf các cỡ: 0,2; 0,5; 1,5ml
§ Hộp
để đầu týp
§ Giá
để đầu tube
§ Ống
nghiệm 12
§ Hộp
lồng, bình cầu, ống đong
§ Chai
0,5lít, 1 lít
§ Găng
tay các cỡ
7.3.
Sinh phẩm hóa chất
Bảng
1: Các đoạn mồi dùng
trong kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng khang sinh của vi khuẩn
|
STT
|
Thiết
kế mồi
|
Trình
tự mồi (5’-3’)
|
Kích
thước cặp mồi (bp)
|
Mã
hóa kháng sinh
|
|
1
|
dfrA1-B
|
TTAACCCTTTTGCCAGATTT
|
500
|
Trimmethoprim
|
|
dfrA1-F
|
GTGAAACTATCACTAATGG
|
|
2
|
TetA
(classD)-B
|
GCAACTCTAATGCCACTGTG
|
1200
|
Tetracycline
|
|
TetA
(classD)-F
|
TCGCTGGTAGCTTCGCTATT
|
|
3
|
strA-B
|
CCAATCGCAGATAGAAGGCAA
|
495
|
Streptomycin
|
|
strA-F
|
TTGATGTGGTGTCCCGCAATG
|
|
4
|
Sulll-B
|
TGTGCGGATGAAGTCAGCTCC
|
626
|
Sulfonamide
|
|
Sulll-F
|
AGGGGGCAGATGTGATCGAC
|
|
5
|
Intl-B
|
CTCTATGGGCACTGTCCACATTG
|
800
|
Yếu
tố SXT
|
|
Intl-F
|
GCTGGATAGGTTAAGGGCGG
|
|
6
|
Tem-Fc
|
TTTTCGTGTCGCCCTTATTCC
|
798
|
b-lactamase
|
|
Tem-R
|
CGTTCATCCATAGTTGCCTGACTC
|
|
7
|
Kp-ndm1-F
|
atgcacccggtcgcgaagctgag
|
499
|
Carbapenem
|
|
Kp-ndm1-R
|
ttcgacccagccattggcggcga
|
§ Canh
thang LB (promega)
§ Thạch
dinh dưỡng
§ NaCl
0,09%
§ Dung
dịch đệm TAE 10X
§ Nước
cất
§ Thạch
điện di (electrophoresis agar)
§ Thang
chuẩn ADN 100bp
§ Ethidiumbromide
§ Chứng
dương:
o V.
cholerae O1
VN01/07: mang các gen tet, dfrA và Class
1 intergron
o K.
pneumoniae VN-17/10:
mang các gen NDM-1
§ Chứng
âm: E. coli không mang gen kháng kháng sinh
8.
TIẾN
HÀNH KỸ THUẬT PCR
8.1.
Tách
chiết ADN khuôn mẫu:
8.1.1. Tách
chiết từ chủng vi khuẩn
- Lấy
4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất.
- Đun
cách thủy ở 950C trong 5 phút.
- Ly
tâm 10.000 vòng/2 phút lấy nước nổi làm khuôn mẫu ADN.
8.2.
Chuẩn
bị hỗn hợp phản ứng PCR
8.2.1. Cách
pha mồi (primers) cho phản ứng PCR:
Bảng
2: Cách pha mồi
|
Primers
(mồi)
|
Primer
đặc
(100µM/µl)
|
Nước cất siêu
sạch
|
Nồng độ pha
loãng
|
Primer cần dùng cho
30µl phản ứng
|
|
dfrA1-B
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
dfrA1-F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
TetA
(classD)-B
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
TetA
(classD)-F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
strA-B
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
strA-F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
Sulll-B
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
Sulll-F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
Intl-B
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
Intl-F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
Kp-ndm1-F
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
|
Kp-ndm1-R
|
10
µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
1µl
(1µM)
|
8.2.2. Hỗn
hợp phản ứng cho PCR đơn mồi bằng Master-Mix (promega)
|
Thành phần phản
ứng
|
1 mẫu
(µl)
|
10 Mẫu
(µl)
|
|
2X Master-Mix
|
15
|
150
|
|
Cặp primers
|
1
|
10
|
|
1
|
10
|
|
Nước siêu sạch
|
10
|
100
|
|
Tổng số:
|
27
|
270
|
§ Trộn
đều chia mỗi tube 27µl.
§ Cho
3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
8.3.
Thực
hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt
8.3.1.
Chu
trình PCR cho các gen kháng sinh: tetA. dfrA, strA, Sull và
int
|
Các
bước
|
Nhiệt
độ
|
Thời
gian
|
|
Biến tính
|
940C
|
5 phút
|
|
Biến tính
|
950C
|
60 giây
|
|
Gắn mồi
|
550C
|
45 giây 30
chu kỳ
|
|
Tổng hợp
|
720C
|
1,2 phút
|
|
Kết thúc
|
720C
|
5 phút
|
|
Giữ ở nhiệt độ
40C
|
8.3.2. Chu
trình PCR cho các gen kháng sinh NDM-1
|
Các
bước
|
Nhiệt
độ
|
Thời
gian
|
|
Biến tính
|
940C
|
4 phút
|
|
Biến tính
|
940C
|
36 giây
|
|
Gắn mồi
|
600C
|
36 giây 30
chu kỳ
|
|
Tổng hợp
|
720C
|
50 giây
|
|
Kết thúc
|
720C
|
5 phút
|
|
Giữ ở nhiệt độ
40C
|
8.4.
Điện
di sản phẩm PCR
§ Chuẩn
bị gel agarose 2%:
– Cần
1g thạch cho vào dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch bằng lò vi
sóng.
– Để
thạch nguội khoảng 700C đổ khuôn tạo gel.
§ Nhỏ
mẫu:
– Đặt
bản gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TAE 1X.
– Rỏ
5µl thang ADN chuẩn 100bp, các chứng âm, chứng dương và sản phẩm PCR vào các
giếng thạch.
§ Chạy
điện di: Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút.
§ Nhuộm
và chụp ảnh gel:
– Nhuộm
gel trong dung dịch ethidium bromide (10mg/ml) trong 10 phút rồi rửa bằng nước
cất trong 15 phút.
– Soi
và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel BioDoc-itTM
System.
9.
PHÂN
TÍCH KẾT QUẢ
- Chứng
dương phải rõ ràng.
- Có
vạch trên gel và đúng kích thước khi so sánh với thang ADN chuẩn vạch có hình
ảnh rõ nét, đẹp như hình 1.
Hình 1:
Kết quả PCR phát hiện gen NDM-1 kháng carbapenem của vi
khuẩn
- Nếu
vạch mờ, không rõ:
o Tăng
thể tích điện di.
o Thực
hiện lại phản ứng PCR.
- Mẫu
chứng âm không được có vạch nào, nếu thấy vạch là mẫu đã bị nhiễm và phải làm
lại xét nghiệm.
- Các
mẫu xét nghiệm được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước
tương ứng với các mẫu chứng và thang chuẩn ADN, ghi: (+).
- Các
mẫu không có vạch hoặc có vạch không đúng kích thươc được coi là âm tính, ghi
(-).
10.
KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Độ
nhạy: 100vk/ml
- Độ
đặc hiệu: 100%
- Mẫu
chứng:
- Chứng
âm: E. coli (không có vạch)
- Chứng
dương:
o TetA:
VN107-07
o DfrA:
VN107-07
o StrA:
VN107-07
o Int:
VN107-07
o NDM-1:
K. pneumoniae VN-17/10
PHIẾU TRẢ LỜI KẾT
QUẢ PCR
Người làm xét
nghiệm:……………………………………………………………………………..
Ngày làm xét
nghiệm:………………………………………………………………………………
1. Loại
mẫu:…………………………………………………………………………………...
2. Tách chiết ADN khuôn
mẫu:………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………....................
3. Pha hỗn hợp phản ứng
PCR:
|
Hóa
chất
|
Thể tích cho 1 phản
ứng
|
Thể tích cho N phản
ứng
|
Nồng độ cuối
cùng
|
|
Nước
cất
|
|
|
|
|
Master mix
2X
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Tổng
số
|
|
|
|
4. PCR:
Máy……………………….Chu trình………………………………………………
5. Điện
di:Máy……… Thạch……%. Dung dịch đệm……... Công suất….. Thời gian…..
6. Chụp ảnh gel và phân
tích kết quả:
|
STT
|
Tên
mẫu
|
Kết
quả
|
|
1
|
Chứng
dương
|
|
|
2
|
Chứng
âm
|
|
|
3
|
……..
|
|
|
4
|
……..
|
|
|
5
|
……..
|
|
|
6
|
……..
|
|
|
….
|
|
|
|
Cán bộ xét
nghiệm
|
|
Trưởng
khoa
|