-          Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh.

-          Phương pháp được áp dụng nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân. 

          2. Tiêu chuẩn trích dẫn:

Sử dụng các qui trình trong sách chuyên khảo tại Việt Nam và các qui trình chuẩn thức hiện đang áp dụng trên thế giới về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI).

          3. Giải thích từ ngữ:

          4. Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler-hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.

          5. Giới hạn tham chiếu: Phương pháp này không áp dụng để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn này phát triển chậm và nghèo trên thạch Meuler-hinton.

          6. Phương pháp xác định:

6.1.    Loại mẫu: Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong các vụ dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh.

6.2.    Thiết bị, dụng cụ

-          Tủ lạnh.

-          Tủ ấm 37⁰C.

-          Máy trộn Voltex.

-          Thước đo vòng vô khuẩn.

-          Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh (Dispensing apparatus).

-          Cân phân tích.

-          Đèn cồn.

-          Thùng khử trùng.

-          Que cấy vi khuẩn.

-          Bình cầu 500ml.

-          Hộp lồng nhựa đáy phẳng có đường kính 90mm.

-          Pipét 1ml, 5ml, 10ml các loại.

6.3.     Hoá chất, thuốc thử:

6.3.1.    Thạch Mueller-Hinton: Sử dụng thạch Mueller-Hinton bột đã được kiểm định chất lượng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường.

6.3.2.    Khoanh giấy kháng sinh:

6.3.3.    Nước muối sinh lý

            Hòa tan NaCl trong nước cất 2 lần.

Chỉnh pH = 7. Sấy khử trùng 121⁰C/15 phút.

Để trong chai vặn kín để tránh bay hơi và để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vòng 6 tháng.

6.3.4.    Độ đục chuẩn (McFarland): Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Nếu độ đục chuẩn được hàn kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong vòng 6 tháng. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.

-          Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường. Hoặc có thể tự chuẩn bị bằng cách trộn:

6.3.5.    Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)

-          Escherichia coli  ATCC 25922

-          Escherichia coli  ATCC 35218

-          Giữ các chủng chuẩn ở -70⁰C trong môi trường canh thang có chứa 10% glycerol trong vòng 3 năm. Trước khi sử dụng cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng chuẩn. Các chủng chuẩn có thể được giữ trong các ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2-8⁰C trong vòng 2 tuần.

6.4.     Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu

-          Các chủng vi khuẩn sau phân lập, trước khi làm thử nghiệm kháng sinh đồ được bảo quản trong thạch mềm, hoặc thạch nghiêng.

-          Khi vận chuyển, các chủng vi khuẩn phải được bảo quản trong các ống giữ chủng có nắp xoáy và đóng gói như hình 1 và vận chuyển về phòng thí nghiệm.

-          Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần.

-          Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.

-          Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7.2 – 7.4 nếu cần.

-          Hấp tiệt trùng ở 121⁰C/15 phút, để nguội môi trường tới 50⁰C.

-          Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch).

-          Lưu ý:

o    Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng.

o    Đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm: Nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.

o    Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chưa dùng ngay thì gói kín và bảo quản ở trong tủ lạnh (2-8⁰C) và sử dụng trong vòng 2 tuần.

o    Khi sử dụng, nếu mặt thạch ướt thì phơi các đĩa thạch trong tủ ấm (35-37⁰C) khoảng 15-30 phút. Không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm.

                ·         Kiểm định chất lượng của mỗi lô thạch:

-          Kiểm tra pH của môi trường trước khi đổ đĩa, pH phải nằm trong khoảng 7,2-7,4. Nếu nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác. 

6.5.2.    Chuẩn bị chủng vi khuẩn & Pha hỗn dịch vi khuẩn

-          Mỗi chủng vi khuẩnthử nghiệm trước 1 ngày cần được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế (thạch dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch não tim), để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.

-          Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 37⁰C. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.

-          Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen. Lưu ý, cần phải trộn đều ống đục chuẩn trước khi dùng.

-          Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.

-          Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng cách lấy 20µl huyền dịch này cho vào 2ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 10⁶ vi khuẩn /ml.

-          Ngoài ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường (canh thang Mueller-Hinton, canh thang não tim, hoặc canh thang trypton soy). Ủ ở 37⁰C cho tới khi vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có được độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm.

6.5.3.    Láng vi khuẩn lên đĩa thạch

-          Sử dụng ngay huyền dịch nồng độ 10⁶ vi khuẩn/ml (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton.

-          Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.

-          Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch.

-          Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus), dụng cụ này phải được đóng nắp chặt, cất trở lại vào trong tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

-          Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch.

-          Không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.

-          Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.

-          Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.

       Khoa: ……………………………Buồng ……... Giường ……………………………

       Chẩn đoán: ……………………………………………………………………………...

       Bệnh phẩm: …………………………………………………………….......................

       Chủng vi khuẩn: ………………………………………………………………………..

                                                                                                                     Ngày …… tháng ……… năm ……

-          Các chủng chuẩn quốc tế phải được thử nghiệm song song với các chủng thử nghiệm nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả.

-          Tuân thủ một cách chính xác qui trình xét nghiệm.

-          Mặc quần áo bảo hộ lao động, đội mũ, đeo găng và mang khẩu trang.

          11. Tài liệu tham khảo:

-          Nguyễn Thanh Hà. Phương pháp kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật Y học. Nhà xuất bản Y học, Hà nội, 1991:32`9-338.

-          Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twentieth informational supplement M100-S20; 30(1), 2010.

Phụ lục 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả

-          Môi trường sử dụng không phù hợp với hướng dẫn của các nhà sản xuất. Ví dụ, khi thạch có nồng độ thymidine hoặc thymine quá cao sẽ gây ức chế sulfonamide sẽ làm vòng ức chế trở nên nhỏ hơn hoặc không rõ ràng tạo nên kết quả kháng thuốc giả, trong khi vi khuẩn vẫn còn nhạy cảm. Thạch đổ quá dày (chuẩn từ 3-4mm) hoặc pH không đúng (chuẩn 7,2-7,4) cũng sẽ ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm.

-          Huyền dịch vi khuẩn làm thử nghiệm không thuần, nồng độ vi khuẩn không đúng với nồng độ Mcfarland chuẩn sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Ví dụ: Nếu nồng độ vi khuẩn thấp có thể cho kết quả nhạy cảm giả và ngược lại.

-          Bảo quản khoanh giấy kháng sinh không đúng hoặc khoanh giấy quá hạn, hoạt tính kháng sinh có thể đã giảm. Điều này thường dễ nhận thấy thông qua sự giảm đường kính vòng ức chế của các chủng chuẩn.

-          pH của thạch   Mueller-Hinton phải được kiểm tra khi chuẩn bị. pH phải nằm trong khoảng   7,2 -7,4 sau khi đông. Nếu pH quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của kháng sinh nhóm aminoglycosides, quinolones và macrolides và có thể làm tăng hoạt tính của tetracyclines. Nếu pH quá cao cũng cho các kết quả không chính xác.

Bảng 1. Giới hạn cho phép đối với các chủng kiểm tra chất lượng dùng trong kiểm soát độ chính xác của phương pháp khoanh giấy khuếch tán của các chủng dễ nuôi cấy (Sử dụng môi trường Mueller-Hinton không bổ sung máu và các thành phần khác) [CLSI, 2010].

       Lưu ý: Mỗi phòng thí nghiệm nên quyết định lựa chọn kháng sinh nào trong bảng 1, đồng thời nên tham khảo tư vấn của các bác sỹ lâm sàng, các dược sỹ, hội đồng chống nhiễm khuẩn, hội đồng điều trị và dược lâm sàng của bệnh viện, cục khám chữa bệnh, cục y tế dự phòng bộ y tế…

      Bảng 2. Tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng ức chế đối với Enterobacteriaceae

                         LƯU Ý:  Khi so sánh kết quả với các giới hạn trong bảng, cần chú ý dấu “≥” và “≤