5.1. Cách pha kháng sinh
5.1.1.1. Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: dựa trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), ta sẽ tính để pha dung dịch mẹ theo công thức sau:
Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, nếu cần pha 10 ml dung dịch kháng sinh mẹ có nồng độ 1600 mg/ml, sẽ phải cân Xg kháng sinh:
Kháng sinh bột sau khi được cân, sẽ pha với dung dịch đệm thích hợp (xem 6.1.), tùy theo mỗi loại kháng sinh khác nhau sẽ có những dung môi và dung dịch đệm khác nhau (phụ thuộc từng hãng sản xuất loại kháng sinh).
Nhiều loại kháng sinh có thể hoà tan và được pha loãng trong nước cất. Một số khác cần phải hoà tan trong các dung môi đặc biệt, sau đó mới được pha loãng trong nước cất. Ví dụ:
|
Kháng sinh
|
Chất hòa tan
|
Chất pha loãng
|
|
Ampicillin
|
Dung dịch đệm phosphat pH 8
|
Dung dịch đệm phosphat pH 6
|
|
Cephalosporin
|
Dung dịch đệm phosphat pH 6
|
Nước cất
|
|
Tetracyclin
|
Cồn methanol
|
Nước cất
|
|
Trimethoprim
|
Cồn methanol
|
Nước cất
|
|
Sulfamethoxazol
|
NaOH 2M
|
Nước cất
|
|
Chloramphenicol
|
Cồn ethanol 100%
|
Nước cất
|
|
Rifampycin
|
Cồn ethanol 100%
|
Nước cất
|
|
Erythromycin
|
Cồn ethanol 100%
|
Nước cất
|
|
Acid fusidic
|
Cồn ethanol 100%
|
Nước cất
|
Dung dịch kháng sinh gốc sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh - 200C. Một khi đã lấy ra, chỉ dùng trong phạm vi một ngày.
5.1.1.2. Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho tiêm truyền tĩnh mạch: là bột kháng sinh không tinh khiết, vì đã có tá dược hòa lẫn trong bột kháng sinh để dễ hòa tan với dung dịch hồi chỉnh hoặc nước cất khi tiêm, sẽ không có chỉ số hoạt lực của kháng sinh. Vì vậy sẽ không thể cân bột kháng sinh để pha dung dịch kháng sinh mẹ được (vì sẽ không chính xác). Vậy muốn có dung dịch mẹ: pha toàn bộ lọ kháng sinh đó với một lượng nước hồi chỉnh hoặc nước cất theo chỉ dẫn (có trên nhãn của lọ kháng sinh), từ đó tính được nồng độ của dung dịch mẹ.
Ví dụ: 1 lọ kháng sinh Ampicillin dùng cho tiêm truyền có 1g bột hòa với 5 ml nước cất, như vậy nồng độ kháng sinh của dung dịch mẹ này là: 200.000 mg/ml, tiếp tục pha loãng trong dung dịch đệm phosphat pH 6 hoặc nước cất đến khi có nồng độ cần thiết. Chia nhỏ vào các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh - 200C. Một khi đã lấy ra để tan băng, chỉ dùng trong phạm vi một ngày.
|
Dung dịch “mẹ”
|
Dung dịch đệm PBS *
(hoặc nước cất)
|
Độ pha
|
Đậm độ trung gian (mg/ml)
|
Đậm độ cuối cùng (mg/ml)**
|
|
2,5 ml (1280 mg/ml)
2 ml
1 ml
0,5 ml
0,5 ml
|
-
2ml
3 ml
3,5 ml
7,5 ml
|
-
1/2
1/4
1/8
1/16
|
1280
640
320
160
80
|
128
64
32
16
8
|
|
2ml (80 mg/ml)
1 ml
0,5 ml
0,5
|
2 ml
3ml
3,5 ml
7,5 ml
|
1/2
1/4
1/8
1/16
|
40
20
10
5
|
4
2
1
0,5
|
|
2ml (5 mg/ml)
1 ml
0,5 ml
0,5 ml
|
2 ml
3ml
3,5 ml
7,5 ml
|
1/2
1/4
1/8
1/16
|
2,5
1,25
0,64
0,32
|
0,25
0,125
0,064
0,032
|
|
2ml (0,32 mg/ml)
1 ml
|
2 ml
3ml
|
1/2
1/4
|
0,16
0,08
|
0,016
0,008
|
* PBS: Dung dịch đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh (xem 6.2.).
** Đậm độ cuối cùng được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH, hoặc 0,2 ml dung dịch trung gian +1,8 ml canh thang MH (pha loãng 1/10).
Ngày 1:
- Tất cả các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế, đều được cấy trong canh thang thường (hoặc trên môi trường thích hợp của từng loại), đặt ở 370C/18h để có được vi khuẩn non. Chú ý điều kiện khí trường theo yêu cầu của từng loại vi khuẩn: H. influenzae, S. pneumoniae, S. pyogenes để trong khí trường có 5% CO2(trong điều kiện không có tủ ấm CO2, tạo CO2 bằng cách cho đĩa thạch vào một bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).
- Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 121oC/15 phút. Đối với một số chủng cần môi trường có chất dinh dưỡng cao phải cho thêm: 5-10% máu (cho các chủng S. pneumoniae), 5-10% máu và hấp cách thủy 80oC/20 phút, lắc đều trong suốt thời gian hấp cách thủy, sau đó cho thêm NAD (đối với chủng H. influenzae). Để thạch nguội còn khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các nồng độ như trong bảng pha kháng sinh, lắc kỹ và đổ vào hộp lồng, khi thạch nguội cất bảo quản trong tủ lạnh 4 - 80C (có thể bảo quản được trong 2 tuần). Mỗi lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất).
Ngày 2:
- Cấy vi khuẩn thuần khiết từ canh khuẩn non (canh khuẩn đã cấy qua đêm 18h) hoặc nhặt một số khuẩn lạc từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước cất) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn/ml (xem 6.3.). Tiếp tục pha loãng 1/100 để có đậm độ vi khuẩn 1-1,5 x 106/ml bằng cách dùng micropipet hút 20 ml cho vào 2 ml đệm PBS (hoặc nước cất).
- Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (1-1,5 x 106/ml) cho vào mỗi giếng, theo sơ đồ đã ghi số của các chủng:
|
1
|
2
|
3
|
4
|
|
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
|
11
|
12
|
13
|
14
|
15
|
16
|
|
17
|
18
|
19
|
20
|
21
|
22
|
|
23
|
24
|
25
|
26
|
27
|
28
|
|
29
|
30
|
Chủng chuẩn*
|
Chủng chuẩn*
|
|
* Tùy theo loài vi khuẩn cần xác định MIC để chọn chủng chuẩn sao cho thích hợp: Với các chủng vi khuẩn đường ruột có thể dùng chủng E. coli ATCC 25922, S. aureus 25923 làm chủng chuẩn, với chủng H. influenzae, S. pneumoiae có thể dùng chủng H. influenzae NCTC 8468 làm chủng chuẩn.
- Dùng bộ phiên bản 32 chân đinh chấm vào giếng sau đó đặt lên đĩa thạch MH có các nồng độ kháng sinh khác nhau (nếu không có bộ cấy phiên bản, có thể dùng micropipet nhỏ 2 ml/chủng lên mặt đĩa thạch theo sơ đồ).
Lưu ý:
· Các đĩa thạch cần được để se mặt thạch trong tủ ấm 37oC/ 30 phút trước khi cấy vi khuẩn.
· Đánh dấu vị trí trên dưới hoặc trái phải của đĩa thạch để tránh nhầm lẫn khi đọc kết quả.
· Đặt vào đĩa thạch MH chứng (không có kháng sinh) trước và sau khi đặt vào các đĩa thạch có kháng sinh.
· Đặt từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao hơn.
· Chú ý cần nhẹ nhàng không để các chân đinh ấn sâu vào trong thạch.
- Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước tại các chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15 phút- 20 phút) cất vào tủ ấm 37oC/18 giờ, lật úp đĩa thạch. Đối với một số chủng cần thiết phải đặt các đĩa thạch trong điều kiện có CO2 (S. pneumoniae, H. influenzae, Branhamella catarrhalis).
Ngày 3:
- Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng không có kháng sinh để kiểm tra sự thuần khiết của chủng vi khuẩn và đảm bảo không bị chết trước khi tiến hành, nếu các chủng đảm bảo thuần khiết và phát triển tốt mới đọc tiếp.
- Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết quả MIC của các chủng này với bảng mẫu (xem 6.5.), nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức: pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng của môi trường, mật độ của vi khuẩn… Như vậy có thể tiếp tục đọc kết quả ở những chủng cần xác định MIC. Nếu không đạt được như trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đúng chuẩn thức.
- Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc.
- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu (xem 6.4.) trên một tờ giấy.
- Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó (£). Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó (>).
Ngày 1:
- Tất cả các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế, đều được cấy trong canh thang thường hoặc BHI để có được canh khuẩn non, theo tỷ lệ sau: trực khuẩn Gram âm: cấy 0,1 ml; Liên cầu D, tụ cầu và trực khuẩn mủ xanh: cấy 0,3 ml; Các liên cầu khác: 0,6 ml (hoặc trên môi trường thạch thích hợp của từng loại). Đặt ở 37oC/ 18 giờ để có được vi khuẩn non. Chú ý điều kiện khí trường theo yêu cầu của từng loại vi khuẩn: H. influenzae, S. pneumoniae, S. pyogenes để trong khí trường có 5% CO2(trong điều kiện không có tủ ấm CO2, tạo CO2 bằng cách cho đĩa thạch vào một bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).
Ngày 2:
- Pha loãng 0,1 ml (100 ml) canh khuẩn non (sau khi để 37oC/18 giờ sẽ có đậm độ tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn ml) trong 9,9 ml canh thang MH (pha loãng 100 lần để có đậm độ tương đương 1-1,5 x 106 vi khuẩn/ml), chia 1,8 ml vào các ống nghiệm đường kính 12 mm. Nếu nuôi cấy qua đêm bằng môi trường thạch, lấy vi khuẩn thuần khiết từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước cất) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn/ml (xem 6.3.), sau đó lại pha loãng 1/100 trong canh thang MH và chia vào các ống nghiệm như trên.
- Thêm 0,2 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng vào 1 ống nghiệm (chứng âm).
- Thêm 0,2 ml kháng sinh đã pha theo bảng pha các đậm độ kháng sinh ở trên vào mỗi ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm.
- Đặt vào tủ ấm 37oC/18 giờ.
Ngày 3.
- Lắc kỹ từng ống nghiệm trước khi đọc kết quả.
- Đọc kết quả ở ống chứng âm trước để kiểm tra xem chủng vi khuẩn có phát triển tốt hay không, nếu vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục đọc kết quả, nếu không mọc tốt phải làm lại thí nghiệm.
- Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn thức quốc tế), so sánh kết quả MIC của các chủng này với bảng mẫu (xem 6.5.), nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức: pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng của môi trường, mật độ của vi khuẩn… Như vậy có thể tiếp tục đọc kết quả ở những chủng cần xác định MIC. Nếu không đạt được như trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đạt được điều kiện chuẩn thức.
- Xác định nồng độ MIC: Đọc kết quả bắt đầu từ ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (bằng mắt thường không nhìn thấy vi khuẩn mọc - canh thang trong).
- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu (xem 6.4.)
- Ở nồng độ thấp nhất, không thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là : nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó (£). Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó (>).
- Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới (xem 6.6.) để phân biệt 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I), kháng (Resistante - viết tắt R).