MỤC LỤC

    I. NGUYÊN TẮC

II. NGUYÊN VẬT LIỆU CƠ BẢN

III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN ELLISA

III.1 Kỹ thuật elisa trực tiếp định loại một số mycobacteria gây bệnh

           III.1.1 Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn phủ bản:

       III.1.2 Quy trình thực hiện ELISA:

III.2 Kỹ thuật elisa xác định kháng thể đặc hiệu kháng M. tuberculosis ở huyết thanh và chất tiết của bệnh nhân lao

III.3 Phân tích kết quả

          III.1.1. Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn phủ bản:

-     Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân trên môi trường Lowenstein trong 8 tuần ở 37⁰C

-         Lấy một lượng vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc trên môi trường bằng khoảng 1/3 -1/2  vòng tròn đầu que cấy, hoà đều trong 0,35 ul PBS. Với chủng chuẩn cũng tiến hành tương tự

-        Đun nóng hỗn dịch vi khuẩn ở 80^oC trong 5 phút để giết vi khuẩn

-         Nghiền (sonicate) sơ bộ hỗn dịch trong 3 giây để làm tan cụm vi khuẩn trong hỗn dịch

-       Đo nồng độ vi khuẩn bằng máy đo quang phổ, bước sóng 420 nm. OD bằng 1,5 tương đương với 1x10⁹ vi khuẩn/ml. Đây là nồng độ cần thiết để phủ bản

          III.1.2. Quy trình thực hiện ELISA:

-         Phủ bản với 25 ul kháng nguyên Mycobacteria (chủng mycobacteria phân lập từ bệnh phẩm, hoà tan với PBS theo nồng độ 2x 10⁹ tế bào vi khuẩn/ml, hoặc xác định nồng độ bằng đo mật độ quang học: OD = 1.50 tương đương với 1 x 10⁹ vi khuẩn/ml ) trong một giếng  ở nhiệt độ 37^oC  qua đêm không đậy nắp hoặc để khô ở nhiệt độ 58-60^oC

-         Phong bế chỗ trống bằng 100ul dung dịch PBS-BSA 1%, ủ ở 37^oC x 1 h

-         Ủ với 50 ul kháng thể đơn clôn kháng đặc hiệu M.tuberculosis, M.avium. M.kansasii đã được pha loãng 1/1.000 lần trong PBS-BSA 1% v.v ở 37^oC x 1 giờ

-        Rửa bản với dung dịch đệm PBS-T 0,05% 3 -5 lần

-         Ủ với 50 ul cộng hợp kháng IgG chuột gắn peroxidaza (pha loãng 1:1.000 lần với PBS-BSA1% ở 37^oC trong 1 giờ

-         Ủ với 100 ul cơ chất  30-60 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối

-         Đọc kết quả ở bước sóng 405nm và ghi nhận kết quả:
OD₄₀₅< 0,8 = âm tính ;
OD₄₀₅>0,8 = dương tính,
hoặc so sánh với kết quả phản ứng của các chủng chuẩn (Bảng 1).

Bảng 1: Phản ứng của kháng thể đơn clôn đối với một số Mycobacteria

 Chú thích:

-         Nhóm M.tuberculosis gồm: M.tuberculosis, M.bovis (BCG), M.africanum và M.microti

-       Nhóm MAIS gồm: M.avium, M.intracellulare, M.scrofulaceum

-         Nhóm M.kansasii gồm: M. kansasii vµ M.gastri

-         Các Mycobacteria khác: M.chelonei, M.flavescence, M.fortuitum, M.gordonae, M.malmoense, M.terae, M.nonchromonicum, M.vaccae, M.xenopi

III.2.  Kỹ thuật elisa xác định kháng thể đặc hiệu kháng M. tuberculosis ở huyết thanh và chất dịch tiết của bệnh nhân lao

1.     Gắn kháng nguyên:Cho 50 ml kháng nguyên gồm vi khuẩn nguyên thể (với nồng độ 10⁹tế bào/ml) hoặc ở dạng siêu nghiền đã pha loãng ở nồng độ 10mg/1ml trong dung dịch đệm PBS vào mỗi giếng của bản, ủ ở 37^oC qua đêm hoặc ở 56^oC trong 4h.

2.     Rửa bản với dung dịch rửa PBS-Tween 0,05% (3-5 lần)

3.    Nhỏ 50 ml huyết thanh bệnh nhân pha loãng với nồng độ tối ưu đối với từng cộng đồng đã được xác định từ trước (với PBS-Tween-BSA 1%) vào mỗi giếng và ủ ở 37^oC/1h

4.     Rửa bản như bước 2

5.     Nhỏ 50 ml cộng hợp  huyết thanh dê kháng IgG hoặc IgM (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp) người  gắn peroxidase vào mỗi giếng của bản, ủ ở 37^oC trong 1h

6.     Làm như bước 2

7.     Cho 100ml cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ trong tủ ấm 37^oC trong 15-30 phút.

8.     Dừng phản ứng bằng cho 100 ml H₂SO₄ vào mỗi giếng

9.     Đọc kết quả với máy đọc ELISA bước sóng 405 nm

Kết quả phản ứng dương tính sẽ là giá trị > giá trị ngưỡng;

Kết quả phản ứng âm tính sẽ < giá trị ngưỡng