|
|
Thời tiết
|
Thường quy và Hướng dẫn kỹ thuật-Giám sát dịch tễ học
Phương pháp phát hiện Cyclospora, Cryptosporidium và Giardia
PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CYCLOSPORA, CRYPTOSPORIDIUM VÀ
GIARDIA TRONG MẪU RAU VÀ PHÂN
Các bước xử lý mẫu rau:
- Cân 10g (10-10,30g) rau vào túi ni lông (Stomacher bag).
- Đong 100 ml 0,01% TWEEN 20 và đổ vào túi đựng mẫu, kiểm tra sao cho rau ngập trong nước trước khi đặt túi vào máy đập rau (Pulsifier).
- Đập mẫu trong 30 giây
- Lấy 1ml ở trong túi để kiểm tra thermotolerant coliform
- Đổ dung dịch trong túi nilông vào 2 tuýp ly tâm 50ml. Đo sao cho mực nước trong hai tuýp là cân bằng.
- Ly tâm 3.500 vòng trong 10 phút. Dùng máy hút chân khôngvà pipét Pasteur lấy toàn bộ dung dịch ra khỏi tuýp và chỉ để lại khoảng 5ml dung dịch còn lại trong tuýp.
- Lặp lại bước 2
- Đập lại mẫu rau trong 10 giây, sau đó chuyển toàn bộ phần dung dịch vào hai tuýp ly tâm 50ml ở trên.
- Ly tâm dung dịch ở 3.500 vòng trong 10 phút. Sau đó dùng máy hút chân không, hút bỏ nước nổi và để lại 5 ml dung dịch còn lại cùng với cặn ở một tuýp, tuýp còn lại cũng hút bỏ nước nổi và để lại 30ml dung dịch cùng với cặn. 5ml dung dịch cùng với cặn sẽ được chuyển sang tuýp thứ hai. Rửa tuýp thứ nhất 2 lần với 5 ml nước cất. Làm đầy tuýp bằng nước cất đến 45ml.
- Lặp lại bước 4 cho tuýp thứ 2.
- Trộn đều huyền dịch trong tuýp và chuyển sang tuýp ly tâm 15ml (tuýp 3). Rửa tuýp ly tâm 50ml với 5 ml nước cất.
- Để loại bỏ các cặn lớn trong huyền dịch trên, bước làm nổi được thực hiện như sau. Đặt một pipet Pasteur vào tuýp 15ml rồi nhỏ 5 ml dung dịch làm nổi với tỷ lệ 1:1 vào pipet trên rồi từ từ nhấc pipet ra khỏi tuýp sao cho dung dịch làm nổi nằm dưới đáy tuýp.
- Ly tâm tuýp trên ở 100 vòng trong 1 phút.
- Chuyển toàn bộ phần nước nổi sang tuýp ly tâm 15ml mới (tuýp 4) và bỏ lại cặn
- Ly tâm tuýp 4 trong 10 phút ở 3.500 vòng. Loại bỏ phần nước nổi và để lại xấp xỉ 2 ml cặn cuối cùng. Rửa phần cặn còn lại bằng nước cất vô trùng.
- Lặp lại bước 15.
- Ly tâm trong 10 phút ở 3.500 vòng, loại bỏ phần nước nổi ở trên và giữ lại 2ml cặn cuối cùng để kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang và PCR.
Các bước phát hiện Cryptosporidium spp và Giardia spp trong mẫu phân và rau:
- Lắc đều cặn và nhỏ 200 ml mẫu vào lam kính định lượng bằng Teflon
- Làm khô lam kính ở 370C xấp xỉ 2 – 3 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng
- Cố định tiêu bản bằng acetone trong một bình giemsa khoảng 5 phút và để khô ở nhiệt độ phòng
- Gắn màu bằng kít miễn dịch huỳnh quang (CELLLABS). Làm màu bằng dye và rửa bằng đệm mounting ở nhiệt độ phòng trước khi dùng. Nhỏ 20 ml dye vào mỗi giếng trên tiêu bản sao cho dye phủ đầy mỗi giếng.
- Ủ ở nhiệt độ 370C khoảng 45 phút trong một khay ẩm ở bóng tối.
- Loại bỏ dye khỏi giếng bằng cách đặt đầu típ vào thành giếng và hút từ từ. Nên dùng típ mới cho mỗi giếng. Nhỏ khoảng 100 ml dung dịch đệm PBS vào mỗi giếng để rửa. Rửa hai lần và sau lần rửa thứ hai, thêm 6ml dung dịch đệm mounting vào mỗi giếng, đặt lam kính lên trên sao cho không có bọt khí nổi lên.
- Lam kính đặt ở trong bóng tối, bào nang sẽ được soi và đếm dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 490nm và vật kính x20.
- Phương pháp PCR sẽ là phương pháp tiếp theo để xác định một cách chắc chắn sự có mặt của Cryptosporidium spp và Giardia spp
Các bước phát hiện Cyclospora spp trong mẫu phân và rau:
Chuẩn bị tiêu bản soi tươi:
- Trộn đều huyền dịch mẫu bằng pipet và nhỏ 22 ml mẫu lên lam kính.
- Phủ lamen lên trên lam kính và sau đó soi dưới kính hiển vi thường và huỳnh quang ở bước sóng 365nm, vật kính x40 để kiểm tra sự có mặt của Cyclospora spp.
- Phương pháp PCR cũng sẽ là phương pháp tiếp theo để xác định một cách chắc chắn sự có mặt của Cyclospora spp.
|
Hội Y học Dự phòng Việt Nam
Trung tâm Dịch vụ KHKT và YTDP
|