QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE
1. MỤC ĐÍCH:
Phát hiện các gen đặc hiệu và gen độc tố tả (cholera toxin A) của V. cholerae O1, O139 và NAG.
2. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phát hiện V. cholerae và độc tố tả từ các chủng vi khuẩn hoặc trực tiếp từ phân, thực phẩm, nước.
3. NGUYÊN TẮC
Sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn gen mã hóa V. cholera O1, O139, NAG và độc tố tả (cholera toxin A) bằng phản ứng chuỗi men. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài phân tử ADN ban đầu qua đó có thể phát hiện được các đoạn gen dưới đèn UV sau khi điện di.
4. TRÁCH NHIỆM
§ Cán bộ thực hiện:
- Thực hiện thao tác xét nghiệm.
- Đảm bảo các mẫu bệnh phẩm được dán nhãn đúng và ghi vào sổ nhận mẫu.
- Hoàn tất báo cáo trả lời kết quả xét nghiệm.
- Đảm bảo kiểm soát chất lượng nội bộ phù hợp với tiêu chuẩn.
§ Trưởng phòng thí nghiệm:
- Duyệt lại các kết quả xét nghiệm.
- Cập nhật các thay đổi của qui trình.
5. AN TOÀN
§ Mặc áo choàng, mang găng tay và khẩu trang khi tiếp xúc với các mẫu bệnh phẩm.
§ Mang găng tay suốt quá trình thao tác kỹ thuật PCR.
6. THÔNG TIN MẪU BAN ĐẦU
|
STT
|
Tên mẫu
|
Dụng cụ chứa
|
Chất thêm vào
|
Số lượng cần có
|
Yêu cấu về vân chuyễn và lưu giữ
|
|
1
|
Chủng vi khuẩn
|
Thạch mềm hoặc thạch dinh dưỡng
|
Không
|
|
Nhiệt độ phòng (2-4 tuần)
|
|
2
|
Phân
|
Lọ vô trùng
|
Không
|
3 g
|
Nhiệt độ phòng (giữ trong ngày)
2-80C (<2 ngày)
|
|
3
|
Nước
|
Chai sạch
|
Pepton kiềm 10X
|
450ml
|
Giữ ở nhiệt độ phòng <3 ngày
|
7. TRANG THIẾT BỊ-HÓA CHẤT-SINH PHẨM
7.1. Thiết bị:
§ Máy luân nhiệt :Mastercycler eppendorf
§ Máy chụp gen
§ Máy điện di
§ Máy ly tâm eppendorf 10.000
§ Máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ
§ Máy khuấy từ
§ Máy trộn vortex
§ Máy đo pH
§ Cân điện
§ Tủ lạnh 40C, -200C và -800C
7.2. Dụng cụ:
§ Que cấy vi khuẩn
§ Micropipette:: 2,5; 10-50; 100-200 và 1000ml
§ Đầu týp các cỡ
§ Tube eppendorf các cỡ: 0,2; 0,5; 1,5ml
§ Hộp để đầu týp
§ Giá để đầu tube
§ Ống nghiệm 12
§ Hộp lồng, bình cầu, ống đong
§ Chai 0,5lít, 1 lít
§ Găng tay các cỡ
7.3. Sinh phẩm hóa chất
Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong kỹ thuật PCR phát hiện gen đặc hiệu của V. choleare
|
Tên mồi
|
Trình tự mồi
|
Gen chỉ điểm
|
Kích thước gen (bp)
|
|
VCO1 F2-1
VCO1R2-2
|
5’ GTT TCA CTG AAC AGA TGG G 3’
5’ GGT CAT CTG TAA GAT CAA C 3’
|
O1
|
192
|
|
VCO139F2
VCO139 R2
|
5’ AGC CTC TTT ATT ACG GGT GG 3’
5’ GTC AAA CCC GAT CGT AAA GG 3’
|
O139
|
449
|
|
AX2
AX3
|
5’ CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G 3’
5’ CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC 3’
|
ctxA
|
564
|
|
101F
837R
|
5’ CCT TCG ATC CCC TAA GCA ATA C 3’
5’ AGG GTT AGC AAC GAT GCG TAA G 3’
|
ToxA
|
779
|
§ Canh thang LB (promega)
§ Thạch dinh dưỡng
§ NaCl 0,09%
§ Kít tách chiết ADN (QIAGEN)
§ Dung dịch đệm TAE 10X
§ Nước cất
§ Thạch điện di (electrophoresis agar)
§ Thang chuẩn ADN 100bp
§ Ethidiumbromide
§ Chứng dương:
o V. cholerae O1: VN01/07
o V. cholerae O139: AI4450
§ Chứng âm: E. coli
8. TIẾN HÀNH KỸ THUẬT PCR
8.1. Tách chiết ADN khuôn mẫu:
8.1.1. Tách chiết từ chủng vi khuẩn
- Lấy 4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất.
- Đun cách thủy ở 950C trong 5 phút.
- Ly tâm 10.000 vòng/2 phút lấy nước nổi làm khuôn mẫu ADN.
8.1.2. Tách chiết trực tiếp từ phân: Sử dụng kit QIAGEN
- Nhỏ 300µl dịch phân tiêu chảy vào týp eppendorf 1,5ml có chứa 600µl NaCL 0.09%.
- Ly tâm 2500 vòng x 2 phút để loại bỏ cặn.
- Hút dịch nổi sang một týp eppendorf mới.
- Ly tâm 13.000 vòng x 10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn.
- Trộn đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch ALT.
- Nhỏ 20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex.
- Ủ 560C trong máy ủ nhiệt cho đến khi vi khuẩn ly giải hoàn toàn (thỉnh thoảng mĩ nhẹ bằng máy trộn voltex).
- Trộn đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch AL, trộn đều sau đó nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều.
- Hút toàn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
- Nhỏ 500µl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
- Rửa cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút.
- Chuyển cột sang týp PCR sạch và nhỏ 75µl dung dịch AE vào trung tâm cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng x 1 phút thu ADN tách chiết để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
8.2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR
8.2.1. Cách pha mồi (primers) cho phản ứng PCR:
|
Primers (mồi)
|
Primer đặc(100µM/µl)
|
Nước cất siêu sạch
|
Nồng độ pha loãng
|
Primer cần dùng cho 30µl phản ứng
|
|
VCO1 F2-1
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.6µl (0.5µM)
|
|
VCO1R2-2
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.6µl (0.5µM)
|
|
VCO139F2
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.3µl (0.25µM)
|
|
VCO139 R2
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.3µl (0.25µM)
|
|
AX2
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl (0.167µM)
|
|
AX3
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl (0.167µM)
|
|
101F
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl (0.167µM)
|
|
837R
|
10 µl
|
30µl
|
25µM/ul
|
0.2µl (0.167µM)
|
8.2.2. Hỗn hợp phản ứng cho PCR đa mồibằng Master-Mix (promega)
|
Thành phần phản ứng
|
1 mẫu (µl)
|
10 mẫu (µl)
|
|
2X Master-Mix:
|
15
|
150
|
|
Primers (mồi)
|
VCO1 F2/R2
|
0.6µl/mồi (0.5µM)
|
12
|
|
VCO139F2/R2
|
0.3µl/mồi (0.25µl)
|
6
|
|
AX2/3
|
0.2µl /mồi (0.167µM)
|
4
|
|
101F/837R
|
0.2µl /mồi (0.167µM)
|
4
|
|
Nước siêu sạch
|
9.4
|
94
|
|
Tổng số:
|
27
|
270
|
§ Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
§ Cho 3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
8.2.3. Hỗn hợp phản ứng cho PCR đơn mồi bằng Master-Mix (promega)
|
Thành phần phản ứng
|
1 mẫu (µl)
|
10 Mẫu (µl)
|
|
2X Master-Mix
|
15
|
150
|
|
Cặp primers
|
VCO1F2
|
0.6
|
6
|
|
VCO1R2
|
0.6
|
6
|
|
Nước siêu sạch
|
10.8
|
108
|
|
Tổng số:
|
27
|
270
|
§ Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
§ Cho 3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
8.3. Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt
|
Các bước
|
Nhiệt độ
|
Thời gian
|
|
Biến tính
|
940C
|
5 phút
|
|
Biến tính
|
940C
|
60 giây
|
|
Gắn mồi
|
550C
|
60 giây 35 chu kỳ
|
|
Tổng hợp
|
720C
|
60 giây
|
|
Kết thúc
|
720C
|
7 phút
|
|
Giữ ở nhiệt độ 40C
|
8.4. Điện di sản phẩm PCR
§ Chuẩn bị gel agarose 2%:
– Cân 1g thach cho vào dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch bằng lò vi sóng.
– Để thạch nguội khoảng 700C đổ khuôn tạo gel.
§ Nhỏ mẫu:
– Đặt bản gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TAE 1X.
– Rỏ 5µl thang ADN chuẩn 100bp, các chứng âm, chứng dương và sản phẩm PCR vào các giếng thạch.
§ Chạy điện di: Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút.
§ Nhuộm và chụp ảnh gel:
– Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide (10mg/ml) trong 10 phút rồi rửa bằng nước cất trong 15 phút.
– Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel BioDoc-itTM System.
9. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
- Chứng dương phải rõ ràng.
- Có vạch trên gel và đúng kích thước khi so sánh với thang ADN chuẩn Vạch có hình ảnh rõ nét, đẹp như hình 1.
Hình 1: Kết quả PCR các chủng chứng dương và chứng âm của V. cholerae O1, O139 và E. coli
- Nếu vạch mờ, không rõ:
o Tăng thể tích điện di.
o Thực hiện lại phản ứng PCR.
- Mẫu chứng âm không được có vạch nào, nếu thấy vạch là mẫu đã bị nhiễm và phải làm lại xét nghiệm.
- Các mẫu xét nghiệm được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước tương ứng với các mẫu chứng và thang chuẩn ADN, ghi: (+).
- Các mẫu không có vạch hoặc có vạch không đúng kích thươc được coi là âm tính, ghi (-).
10. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- Độ nhạy: 100vk/ml
- Độ đặc hiệu: 100%
- Mẫu chứng:
- Chứng âm: E. coli (không có vạch)
- Chứng dương:
o V. cholerae O1: VN107-07(kích thước band 192bp)
o V. cholerae O139: AI4450 (kích thước band 490bp)
o CtxA: AI4450 (kích thước band 564bp)
PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ PCR
Người làm xét nghiệm:……………………………………………………………………………..
Ngày làm xét nghiệm:………………………………………………………………………………
1. Loại mẫu:…………………………………………………………………………………...
2. Tách chiết ADN khuôn mẫu:………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………..
3. Pha hỗn hợp phản ứng PCR:
|
Hóa chất
|
Thể tích cho 1 phản ứng
|
Thể tích cho N phản ứng
|
Nồng độ cuối cùng
|
|
Nước cất
|
9,4
|
9,4 x N
|
|
|
Master mix 2X
|
15
|
15 x N
|
1X
|
|
Mồi O1, O139, ctxA, toxA
|
2,6
|
2,6 x N
|
|
|
Tổng số
|
27
|
|
|
4. PCR: Máy……………………….Chu trình………………………………………………
5. Điện di:Máy……… Thạch……%. Dung dịch đệm……... Công suất….. Thời gian…..
6. Chụp ảnh gel và phân tích kết quả:
|
STT
|
Tên mẫu
|
Kết quả
|
|
1
|
Chứng dương
|
|
|
2
|
Chứng âm
|
|
|
3
|
……..
|
|
|
4
|
……..
|
|
|
5
|
……..
|
|
|
6
|
……..
|
|
|
….
|
|
|
|
Cán bộ xét nghiệm
|
|
Trưởng khoa vi khuẩn
|